qPCR原理
实时荧光定量PCR（Real Time Quantitative PCR）是一种实时检测PCR扩增产物并进行解析的方法。由于其具有操作简便、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，被广泛的应用于医学检测、药物疗效评价、基因表达分析、拷贝数变异检测、基因分型、病原体检测、残留检测等领域。其通过在扩增过程中引入荧光染料或荧光探针，实时监测PCR反应中DNA的扩增量，以此实现核酸的定量检测。
基本原理
qPCR与传统的PCR扩增的基本步骤相同，包括了变性、退火和延伸。然而qPCR的关键区别在于实时荧光检测以及定量方式。在qPCR中，反应以循环中的首次检测到的目标扩增的时间为特征，而非在一定循环后目标分子累计的扩增量。目标核酸的起始拷贝数越高，则会越快观察到荧光的显著增加。相反，终点法检测测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。
扩增曲线
在qPCR进程中，随着产物的积累，荧光信号的强度等比加强。每经过一次循环，收集一次荧光信号，即可得到一个荧光扩增曲线。
上图是一张经典的qPCR扩增曲线图。根据荧光强度的变化即可监测产物量的变化。荧光扩增曲线可分为三个阶段，即荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此可以在该阶段进行定量分析。
定量原理
为了便于对所检测样本进行比较，在指数期需要设定一个荧光信号的阈值。检测到的荧光信号超过阈值则被认为是真正的信号。荧光信号由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数称为Ct值。在指数扩增期，PCR每进行1个循环，DNA呈2倍的指数关系增长，直到平台期。假设模板量为A0，则经过n个循环后，扩增产物理论值An应为：
那么，起始模板拷贝数A0越多，扩增产物的量便越早达到检出值An，达到An时的循环次数即Ct值。也就是起始模板拷贝数A0越多，扩增曲线越早起峰，对应需要的循环次数n越小。由上可得，模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在反比线性关系，即起始拷贝数越多，则Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品及其相应的Ct值可绘制出标准曲线，测得未知样品的Ct值后，根据标准曲线便可准确计算出该样品的起始拷贝数。
荧光检测方法分类
荧光探针法
Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。当探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；当PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光发射基团荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而实现定量。目前常用的荧光基团有FAM, TET, VIC, HEX。
荧光探针具有与DNA靶标和引物匹配的双重特异性，这一特点显著降低了非特异性扩增的可能性，并且由于其高特异性，不需要对扩增产物进行特异性验证（熔解曲线）。同时在同一体系中，可以设计多种荧光标记的探针及引物，实现多个靶标的同时检测。
该方法由于特异性高，需要探针针对特定靶标而设计，一旦靶标发生变化或者含量降低，都会显著影响该方法的定量从而需要重新设计引物探针。同时，其引物探针的设计较为复杂，既需要精准且高度匹配目标序列，有要避免与引物重叠，同时还要保证引物探针自身的稳定性和合理性，如比较适当的长度（15-25bp），合理的结构（合理的GC数量、避免形成二聚体或者发夹结构），适宜的Tm值等。该方法引物探针的合成成本也较高。
荧光染料法
目前常用的荧光染料是SYBR Green I，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
该方法由于其不需要与模板特异性结合的探针，所以无需设计和优化探针，仅需要探针即可。同时染料可以结合所有扩增的dsDNA，无需针对靶标制定试剂。同时染料的成本也较低，只需用到通用的染料即可。
该法由于其特性较低，无法区分目标产物和特异性产物（如引物二聚体或者非靶标DNA）。由于该特性，在扩增结束后，需要进行熔解曲线分析以验证扩增产物的特异性。
